Отправлено: 06.11.09 22:36. Заголовок: СРАВНИТЕЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОПЫТАХ ПО УСТОЙЧИВОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМ

Доктор биол. наук, профессор Ю.Д. Сосков
Кандидат фарм. наук А.А. Кочегина

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ УЧЕТ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОПЫТАХ ПО УСТОЙЧИВОМУ БИОЛОГИЧЕСКОМУ МИНИЗЕМЛЕДЕЛИЮ

//ГУМУС И ПОЧВООБРАЗОВАНИЕ: НАУЧНЫЕ ТРУДЫ СПБ ГАУ.- 2005.- С. 64-73.

Растительный слой Земли по Чарльзу Дарвину [1] возник благодаря жизнедеятельности дождевых червей. Огромная роль в переработке расти-тельных и животных остатков в почве и создании почвенного плодородия принадлежит и различным группам микроорганизмов из царств грибов и дробянок – различным видам грибов и бактерий. По данным отечественных микробиологов, количество клеток микроорганизмов в 1 г почвы достигает нескольких миллиардов [2, 5]. Особенно актуальным нам представлялось выявление живых почвенных микроорганизмов, реально участвующих в обеспечении почвенного плодородия.
Цель нашего исследования – определить количество клеток микроорганизмов в почвах в опытах по биологическому миниземледелию при возделывании картофеля. Для этого были заложены опытные делянки на двух различных по составу почвах. Картофель немецкого сорта Гранола возделывали двумя различными методами устойчивого биологического миниземледелия : по В.П. Ушакову (Россия) и методу Джона Джевонса (США). Метод В.П. Ушакова демонстрировался на ВДНХ в 90-х гг. ХХ века. Метод Д. Джевонса успешно используют садоводы 108 стран мира. Однако научных исследований по внедрению этих методов в нашем регионе мы не встречали. Оба метода позволяют повысить урожайность картофеля в первые 3 года возделывания до 2-3, а затем и более раз по сравнению с контролем при одновременном росте почвенного плодородия. Севооборот для возделывания такой требовательной к почвенному плодородию культуры, как картофель, при этом не требуется. Оба метода базируются на использовании компостов в качестве удобрений.
Выращивание картофеля на опытных делянках по методу В.П. Ушакова проводили в течение 6 лет, Джона Джевонса - в течение 3 лет, одновременно изучали образцы почв на контрольных делянках с использованием только минеральных удобрений и традиционном возделывании картофеля, а также различные варианты компоста в течение 3лет.
В 2000 г. с помощью электронного микроскопа было изучено 13 образцов почв, в 2001 г.- 5 образцов методом электронной микроскопии и одновременно методом высева водных суспензий почв на питательные среды c последующим традиционным микроскопическим изучением.
Опыты по биологическому миниземледелию проводили в Санкт-Петербурге на Агроэкологическом комплексе «Живая Земля» (АЭК ЖЗ) СПб городского Дворца творчества юных (СПб ГДТЮ) на городских окультуренных почвах с высоким содержанием гумуса (12,5 %) и в Пушкине (СПб) на Северном поле ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВНИИР) на типичных дерново-подзолистых тяжело- и легкосуглинистых почвах с содержанием гумуса 4,0-5,5 % [3,8]. Изучение образцов почв проводили во ВНИИ защиты растений (ВНИИЗР) в лаборатории электронной микроскопии (кандидат биол. наук Е.В. Моржина) и одновременно на питательных средах в лаборатории мик-робиологической защиты растений (кандидат биол. наук И.В. Бойкова).
.
Методы исследований

1. Метод количественного учета микроорганизмов в почвах с использо-ванием электронной микроскопии.
За основу был взят метод электронной микроскопии для количест-венного определения микроорганизмов в суспензиях почв по Д.И. Никитину и Е.Д. Макарьевой [6, 4]. Образцы почвы отбирали в контейнеры для выращивания растений буром Некрасова, каждый образец из 15 мест одного и того же варианта, на глубину 20 см, общей массой около 200 г. В этот же день были приготовлены препараты для просмотра на электронном микроскопе (анализы были выполнены в 2000 и 2001 гг.) и для высева на питательные среды (анализ 2001 года). С этой целью 1 г свежей почвы каждого образца увлажняли несколькими каплями воды и перетирали в фарфоровой чашечке в течение 3 минут до пастообразного состояния. Почву смывали в пробирку 10 мл водопроводной воды, которая была предварительно проверена на отсутствие микроорганизмов. После тщательного перемешивания жидкости, 1 мл суспензии из средней части первой пробирки переносили пипеткой во вторую пробирку с 9 мл воды, из второй – в третью и т.д. Было сделано десять десятичных разведений. В 6-7 разведениях было много «грязи», а в 9 разведении – мало клеток, поэтому за основу было взято восьмое (10-8) разведение и линейное увеличение в 1000 раз. Из средней части восьмой пробирки микропипеткой объемом в 0,1 мл отбирали для анализа небольшой объем суспензии, из которой одну капельку объемом 5 мм3 (5 микролитров) перенесли на сеточку (бленду) диаметром 3 мм (7,065 мм2). После высыхания капельки на бленде ее оттеняли окисью вольфрама и затем просматривали под электронным микроскопом. Смотровые поля каждого образца со средним количеством клеток микроорганизмов фиксировали на 5 негативах с увеличением в 1000, 3000, 7000, 10000 и 20000 раз.
Для определения количества смотровых полей (f) в бленде сначала вычисляли площадь смотрового поля (S2) путем деления площади негатива (5780 мм2) на величину линейного увеличения (m) микроскопа в квадрате (5780 мм2 : 10002 = 0,00578 мм2 ). Затем, площадь бленды (S1 = 7,065 мм2) делили на площадь смотрового поля (S2) и получали количество смотровых полей в бленде (f = 7,065 мм2 : 0,00578 мм2 = 1220 полей ). Количество смотровых полей в бленде (f) составило: при увеличении в 1000 раз – 1220, в 3000 раз – 9429, в 5000 раз – 26170, в 8000 раз – 64230, в 20000 раз – 353250 полей.
В отличие от метода Д.И. Никитина, во избежание занижения числен-ности микроорганизмов в почвенных образцах, мы не проводили гомогенизирование суспензии почвы на магнитной мешалке в течение часа и не подвергали ее диализу в стерильной дистиллированной воде в течение 3-12 ч. Почвенные образцы отбирали поздно осенью во 2-3 декадах октября, когда однолетние растения прекращали вегетацию и у них отмирала корневая система, в результате чего появлялось много пищи и почвенная микрофлора активизировалась. Таким образом, сам процесс подготовки почвы до фиксации препаратов окисью вольфрама был равен времени одного деления почвенных микроорганизмов, то есть составлял не более 20-30 мин. Дистиллированную воду для разведения суспензии почвы также не применяли, так как она могла воздействовать на микроорганизмы неблагоприятным образом.
Известно также [2: 233], что при повышении плотности микроорга-низмов в почве свыше 106 клеток, при недостатке пищи, начинают активно действовать механизмы антибиоза – поедание микроорганизмов клеточными паразитами из простейших и других групп.
Расчет количества клеток микроорганизмов (M) в 1 г почвы при электронной микроскопии производили по формуле:
M = n × f : v : p, где (1)
n - количество клеток микроорганизмов в смотровом поле электронного микроскопа, штук (то есть на негативе, например, 10 клеток)
f - количество смотровых полей в сеточке (бленде), штук (например, 1220 полей)
v - объем капли микропипетки, мл (например, 0,005 мл или 200 ка-пель в 1 мл)
p - разведение водой 1 г почвенного образца ( например, 10-8 или в 0,00000001 раз)
f = S1 : S2 , где (2)
S1 - площадь сеточки (бленды), мм2 (например, 7,065 мм2 , определяется по формуле πτ2 = 3,14 × 1,5 мм2)
S2 - площадь смотрового поля в бленде, мм2 ( например, 0,00578 мм2, определяется делением площади негатива на величину квадрата линейного увеличения микроскопа, 5780 мм2 : 10002 )
В преобразованном виде формула выглядит следующим образом:

M = n × S1 : S2 : v : p (3)

В формуле Д.И. Никитина и Е.Д. Макарьевой [6] для количественного учета микроорганизмов в суспензиях почв использованы несколько иные параметры, чем в нашей методике. Когда же мы под понятием «n» (количество клеток в 1 мл суспензии) указанных авторов приняли количество клеток в смотровом поле микроскопа, то получили те же результаты, что и по нашей формуле.
2. Метод количественного учета жизнеспособных микроорганизмов в почвах с использованием питательных сред.
Пять образцов (2001 г.) были изучены одновременно методами элек-тронной микроскопии и традиционной микроскопии с использованием культивирования микроорганизмов на питательных средах.
Взвешивали 1 г почвы, увлажняли, растирали навеску, производили 8-е десятичное разведение (10-8), как это описано выше при электронной микроскопии, но только уже в стерильных условиях. Один миллилитр исследуемой суспензии 8-го разведения вносили в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 100 мл стерильной водопроводной воды. Колбы ставили на качалку на 20 мин. В стерильные пробирки помещали некоторое количество почвенной суспензии из колбы. Суспензию в пробирке отстаивали в течение одного часа. Из пробирки отбирали стерильной пипеткой пробы из верхнего прозрачного слоя, пипеткой вносили по 0,05 мл отобранной пробы на одну стерильную чашку Петри с питательными средами: МПА (мясо-пептонный агар), сусло-агар, среда Чапека. В эксперименте использовали по три чашки каждой среды на одну пробу. Тщательно растирали пробу шпателем на поверхности среды. Чашки ставили в термостат на 2-7 дней при температуре + 28оC.
После появления колоний на чашках Петри подсчитывали число микроорганизмов в 1 г почвы следующим образом. Так как 1 мл суспензии из 8-го десятичного разведения разводили в 100 мл воды, а на одну чашку вносили по 0,05 мл, то в одной чашке Петри вырастали микроорганизмы, содержащиеся в 5 × 10-4 мл суспензии. Рассчитывали среднее количество колоний микроорганизмов на одну чашку и делили на 5×10-4, и затем на 10-8. Таким образом, получали среднее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы.
3. Метод компостирования сорняков на АЭК ЖЗ.
В течение вегетационного периода ежегодно прополотую массу сорняков с участка, с остатками земли на корнях, постоянно складывали в три равных компостных бурта высотой 70-80 см. Каждый бурт делили пополам на 2 части с расстоянием между ними 40-50 см. В одну часть бурта вносили навоз из расчета 60 кг/га действующего вещества (д.в.) азота, в другую часть – только минеральное удобрение азофоска, также из расчета 60 кг/га д.в. азота. В 2000 г. удобрения были внесены за один месяц до отбора образцов и в 2001 г.- за три месяца. Отбор образцов производили на глубину 20 см от верхнего, переработанного биотой, созревшего компоста.


Таблица 1

Учет микроорганизмов в образцах почв по данным электронной микроскопии в опытах по биологическому миниземледелию : 1 – выращивание картофеля по методу В.П. Ушакова на
дерново-подзолистых легкосуглинистых почвах (Пушкин); 2 – компости-рование сорняков в буртах на городских окультуренных почвах (Санкт-Петербург).
Размер делянки и бурта по 3 кв.м. Число повторений 3. Разведение образца почвы 8-е (10-8). Дата 28.10.2000 г.

Вариант опыта В поле микроскопа, штук В 1 г свежей
почвы, штук
бактерии мицелий всего
кокки бациллы
1. Северное поле ВНИИ растениеводства (6-й год)
1.1. Опыт: ме-тод Ушакова с органическими удобрениями 9 0 1 10 244 × 1012
1.2. Контроль с минеральными удобрениями 668 2 7 677 16519 × 1012
2. Агроэкологический комплекс «Живая Земля» СПб ГДТЮ (3-й год)
2.1. Опыт: ком-пост: сорняки + навоз (N60 кг/га действующего вещества) 338 2 1 341 8320 × 1012
2.2. Контроль: компост: сор-няки + мине-ральное удоб-рение азофоска (N60 кг/га д.в.) 9800 24 1 9825 239730 × 1012







Таблица 2
Учет живых и мертвых микроорганизмов в образцах почв по данным электронной микроскопии в опытах по биологическому земледелию, в компостах и контрольных вариантах. Размер делянки и бурта по 3 кв. м. Санкт-Петербург, Агроэкологический комплекс «Живая Земля», СПб ГДТЮ. Дата 15.10.2001 г.


№ об-раз-
ца

Вариант опыта Количество клеток микроорганиз-мов в поле зрения микроскопа, штук Количе-ство кле-ток мик-роорган-измов в 1 г свежей почвы, штук
бактерии
грибы (мице-лий)
всего кле-ток

кокки
бацил-лы

1 Метод Джона Джевонса 207 11 5 223 544×1012
2 Традиционный метод (контроль) 149 23 8 180 439×1012
3 Метод В.П. Уша-кова 196 52 76 324 790×1012
4 Земле - травяной компост с навозом (N60 кг/га) 113 30 78 221 539×1012
5 Земле - травяной компост с мине-ральным азотом (N60 кг/га ) 117 31 93 241 588×1012


Таблица 3
Учет живых микроорганизмов в 1 г свежей почвы при посеве ее на питательных средах в опытах по м биологическому земледелию, в компостах и контрольных вариантах. Площадь делянок и буртов 3 м2, число повторений 3. Санкт- Петербург. Дата 15.10.2001 г.

№ об-разца

Вариант опыта Бактерии, млрд. штук (мя-со-пептонный агар) Грибы, тыс. штук (сусло-агар)
Актиномицеты, тыс. штук 0,9×1012 (среда Чапека)
Всего живых клеток, штук
Всего жи-вых клеток, штук (ок-ругленно)
1 Метод Джона Джевонса, 3-й год 880 40 60 880000100×103 0,9×1012 1012
2 Традиционный метод, 6-й год (контроль) 8000 120 40 8000000160×103 8,0×1012
3 Метод В.П. Ушакова, 6-й год 470 360000 34 470360034×103 0,5×1012
4 Земле - травя-ной компост с навозным азо-том (N60 кг/га д.в.) 3000 40000 210 3000040210×103 3,0×1012
5 Земле – травя-ной компост с минеральным азотом (N60 кг/га
д.в.) 1000 400 120 1000000520×103 1,0×1012


Результаты и обсуждение

Поздней осенью, 28.10.2000 г. были взяты пробы 13 образцов почв в опытах по биологическому земледелию для количественного учета микроорганизмов. В Санкт-Петербурге на Агроэкологическом комплексе «Живая Земля» СПб ГДТЮ на городских окультуренных почвах диапазон изменчивости по количеству клеток микроорганизмов в 1 г почвы по образцам составил 2,0×1015 – 239,7×1015 и на Северном поле ВНИИР на типичных дерново-подзолистых легкосуглинистых почвах - 0,2×1015 - 21,6×1015 живых и мертвых клеток микроорганизмов. На всех типах почв, во всех опытах обнаружены сотни – сотни тысяч триллионов клеток микроорганизмов в 1 г свежей почвы. Аналогично высокие показатели, до 17×1017 клеток в 1 г почвы, были обнаружены в компостах Италии [9]. Из 13 образцов резко выделился по количеству клеток только один образец из АЭК ЖЗ СПб ГДТЮ – компост из сорняков с азофоской (N60 кг/га). В среднем, по всем остальным 12 образцам количество клеток в 1 г почвы составило 12,2×1015 при диапазоне изменчивости 0,2×1015 – 26,8×1015 клеток в 1 г почвы. Почвы в опытах по методам биологического земледелия мало отличаются друг от друга по количеству содержащихся в них микроорганизмов.
Из 13 образцов почв заслуживают внимания только две пары образцов, где выявлены существенные различия между опытом и контролем (табл. 1). Так, на Северном поле ВНИИР (Пушкин - Санкт-Петербург) на шестом году выращивания картофеля по методу В.П. Ушакова, в опыте количество клеток микроорганизмов в 1 г почвы составило 0,2×1015, а в контроле с использованием только минеральных удобрений (N60 кг/га д. в.) в 68 раз больше (16,5×1015). На АЭК ЖЗ СПб ГДТЮ в земле - травяном навозном компосте (навоз: 60 кг/га д. в. азота) количество клеток в 1 г почвы составило 8,3×1015, а в контроле только с минеральным удобрением (азофоска: 60 кг/га д. в. азота) в 29 раз больше – 239,7×1015. В обоих случаях внесение азотных минеральных удобрений вызывало резкое увеличение клеток микроорганизмов в 1 г почвы в 29 - 68 раз. В контрольных образцах (табл. 1), где использовали только минеральные удобрения (азофоска: N60 кг/га д.в.) преобладали мелкие кокки, диаметром менее 1 мкм. Количество мелких клеток составило в этих образцах 93,0-99,7 %. В двух других образцах (1,1; 2,1) были обнаружены как мелкие, так и крупные кокки, диаметром 3-7 мкм.
Поздней осенью, 15.10.2001 г., было изучено содержание клеток микроорганизмов в пяти образцах свежей почвы АЭК ЖЗ СПб ГДТЮ двумя методами: электронной микроскопии и традиционной микроскопии с использованием культивирования микроорганизмов на питательных средах. Как известно, клетки почвенных микроорганизмов могут делиться каждые 20-30 мин и еще быстрее погибать от различных факторов. По нашему мнению, время подготовки образцов почв для высева на питательные среды можно было бы еще сократить на 1 час 20 мин, то есть не ставить суспензию на качалку и не отстаивать ее. Согласно таблицы 2 по данным электронной микроскопии в 2001 г. количество клеток микроорганизмов сократилось в опытах по сравнению с 2000 г. в среднем в 51 раз и оставило 0,4×1015 – 0,8×1015 клеток.
На питательных средах (табл.3) получены также высокие показатели по численности живых клеток в 1 г почвы, в среднем 2,7×1012 клеток. По Д.Г. Звягинцеву [2: с.225] на любой питательной среде прорастает обычно 0,1% клеток микроорганизмов от их общего количества, обитающих в почве, то есть в 1000 раз меньше. Если учитывать этот фактор, то можно видеть, что данные по численности микроорганизмов, полученные двумя разными способами, мало различаются. Численность живых клеток микроорганизмов в
образцах почвы при традиционном методе возделывания картофеля (кон-троль) превысила опытные образцы по Джону Джевонсу и В.П. Ушакову в 9-16 раз и содержала 8×1012 клеток в 1 г почвы. Во всех 5 образцах преобладали бактерии, численность которых составила 99,9 % по отношению к грибам и актиномицетам. В земле-травяном компосте (образец №5) с минеральным азотом (азофоска: N60 кг/га д.в.) преобладали очень мелкие бактерии, а также мелкие колонии на питательной среде, диаметром, 2-5 мм с маслянистой поверхностью. В других вариантах опыта (1-4 образцы) бактерии были крупными. Их колонии на питательной среде были также более крупными, диаметром 15-30 мм.
Наши исследования показали, что численность микроорганизмов в почвах намного выше, чем считалось ранее и составляет не миллиарды клеток в 1 г почвы, а многие триллионы. Это подтверждается одновременным использованием двух различных методов - электронной микроскопии и посевом суспензий почв на питательные среды. Почвы в опытах по биологическим методам земледелия мало отличаются друг от друга по количеству клеток микроорганизмов. В то же время численность микроорганизмов в почвах имеет тенденцию возрастать в десятки раз при использовании только одних минеральных азотных удобрений, которые могут быть причиной снижения плодородия почвы за счет минерализации и поглощения гумуса микроорганизмами.

Выводы

1. По данным электронной микроскопии, в 6 образцах городских окультуренных почв (Санкт-Петербург) и в 5 образцах дерново-подзолистых легко- и тяжелосуглинистых почв (Пушкин-СПб), в опытах по биологическим методам миниземледелия и контрольных вариантах выявлено в среднем 10580×1012 клеток микроорганизмов в 1 г почвы с диапазоном изменчивости 244×1012 - 26791×1012 клеток.
2. Наибольшее количество клеток в 1 г почвы обнаружено методом электронной микроскопии в 7 образцах компоста: в среднем 38988×1012 с диапазоном изменчивости 539×1012 - 239730×1012 клеток.
3. В 2000 г. при изучении 13 образцов почв методом электронной микроскопии выявлено два образца из четырех, когда в контроле с использованием только минеральных азотных удобрений N60 кг/га д. в., количество клеток микроорганизмов в 1 г почвы превысило опытные варианты с органическими удобрениями в 29-68 раз (табл.1).
4. Представлена более подробная и понятная формула для расчета количества клеток микроорганизмов в 1 г почвы при электронной микроскопии, чем формула Д.И. Никитина и Е.Д. Макарьевой [6].
5. В 2001 г. при изучении пяти образцов почв с использованием питательных сред выявлено в среднем 2,7×1012 жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г почвы с диапазоном изменчивости 0,5 ×1012 - 8,0×1012 клеток. Образцы почвы в опытах с использованием только минеральных удобрений содержали в 9 раз больше жизнеспособных клеток, чем образцы в опытах с использованием органических удобрений.
6. В образцах почвы и компоста в опытах с использованием только минеральных удобрений преобладали мелкие бактерии, диаметром 1 мкм и меньше (до 93,0-99,7 %).
7. Образцы почвы в опытах с использованием органических удобрений содержат как крупные (3-7 мкм), так и мелкие бактерии (0,5-!,0 мкм). Мелкие бактерии на питательных средах образовывали в 3-6 раз более мелкие колонии, чем крупные.


Финансирование осуществлено по гранту Research Support Scheme 1041/2000, Институт Открытое общество.

Литература

1. Дарвин Ч. Образование растительного слоя Земли деятельностью дождевых червей и наблюдения над образом жизни последних.- М.: А.А.Васильев, 1882.- 186 с.
2. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы.- М.: МГУ, 1987.- 256 с.
3. Кочегина А.А., Сосков Ю.Д., Петрова Е.А., Москалева Н.С., Осипов С.М. Возделывание картофеля и других культур по методу Джона Джевонса // Гумус и почвообразование: Сборник научных трудов СПб ГАУ.- СПб, 2003.- С. 172-178.
4. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. Д.Г. Звя-гинцева.- М.: МГУ, 1991.- 304 с.
5. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология.- 3-е изд.- М.: Агро-промиздат, 1987.- 368 с.
6. Никитин Д.И., Макарьева Е.Д. Применение электронного микроскопа для количественного учета микроорганизмов в суспензиях почв // Почвоведение. 1970. № 10. С. 51-56.
7. Покровская С.Ф. Переработка органических отходов с использованием дождевых червей // Сел. хозяйство за рубежом. 1984. № 5. С.10-14.
8. Сосков Ю.Д., Кочегина А.А., Осипов С.М., Москалева Н.С., Петрова Е.А., Сапунов Л.С. Выращивание картофеля по методу В.П. Ушакова в Санкт-Петербурге // Гумус и почвообразование: Сборник научных трудов СПб. ГАУ.- СПб., 2002.- С.. 158-164.
9. Mizia G. Mondo agricolo.- 1982. Vol. 33, n 10-11. P. 26-27. (Цитировано по С.Ф. Покровской, 1984 г. В ЦНСХБ журнал изъят из фондов).